ACS Chem. Biol. │ ᴱᴿHRP - ᶜʸᵗAPEX实现活细胞内蛋白质转运的监控
英文原题：Monitoring Protein Import into the Endoplasmic Reticulum in Living Cells with Proximity Labeling
通讯作者：Joseph C. Genereux 加利福尼亚大学
供稿人：杨铭栋 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章 “Monitoring Protein Import into the Endoplasmic Reticulum in Living Cells with Proximity Labeling”，文章来自加利福尼亚大学的Joseph C. Genereux课题组。本文中，作者借助ERHRP - cytAPEX这一组合成功地在活细胞内对蛋白质转运过程实行监控。
真核细胞是高度区域化的细胞，在细胞内存在着复杂的有膜细胞器，这为真核细胞中复杂且协调的生物学过程提供了有利场所。同样地，细胞的高度区域化使得蛋白质需要被转运到正确的位置才能发挥正常功能。环境、遗传及其他压力可以诱导蛋白质错误定位，进而威胁细胞的蛋白质稳态。监控蛋白质动态转运并研究相关调控因子将帮助我们理解蛋白质迁移、定位及疾病中蛋白质转运失调的分子机制。但是，目前活细胞中高通量鉴定蛋白质错误靶向的方法比较匮乏，因此难以解析相关调控因子的具体功能。过氧化物酶已成为表征亚细胞蛋白质组及蛋白质-蛋白质相互作用的强有力工具。由于过氧化物酶通过产生不透膜的自由基实现蛋白质的标记，因此其具有较高的时空分辨率。基于此，作者设计如下实验流程实现对蛋白质转运的监控：首先，作者通过遗传编码的方式在两组细胞中分别过表达ER定位或胞质定位的过氧化物酶；随后对细胞进行刺激处理，并在加入过氧化氢进行标记前将探针BP与细胞共孵育；最后在1 min内完成蛋白质的标记，并通过质谱检测刺激引起的差异蛋白质定位。（如图1所示）。
图1：蛋白质转运监控策略。A）鉴定的基本实验流程；B）相较于已进入ER的蛋白质，胞质定位的过氧化物酶优先标记胞质的蛋白质；C）相反，ER定位的过氧化物酶优先标记ER定位的蛋白质。
为优化该实验流程，作者对ER中使用的过氧化物酶进行了筛选。作者考虑了两种过氧化物酶：HRP和APEX2。虽然APEX2在最近的研究中得到了更广泛的应用，但HRP具有两个优势。首先，HRP比APEX2有更快的底物周转和更低的米氏常数；其次，由于胞质的还原环境及较低的Ca2+浓度，未进入ER的HRP应该不能正确折叠，这赋予了该过氧化物酶更高的空间分辨率。为证实这一优势，作者使用Sec61抑制剂ML A/B处理细胞以阻止ER输入新合成的蛋白质，并在该条件下表征了两种酶的标记效果（如图2a所示）。作者发现两种ER定位的过氧化物酶都可以对胞质及ER定位的蛋白质进行标记，但是ERHRP对ER蛋白质的选择性高于ERAPEX（如图2b所示）。因此，在之后的研究中，作者采用ERHRP和cytAPEX这一组合形式。在蛋白质免疫印迹实验中，作者同样表征了ERHRP和cytAPEX对胞质及ER蛋白质的标记情况，两种过氧化物酶都有较好的选择性（如图c所示）。
图2：ER定位过氧化物酶的亚细胞标记选择性。A）通过ML A/B干扰新合成蛋白质向ER的转运；B）ML A/B刺激下，ERHRP与ERAPEX对胞质及ER蛋白质的标记情况；C）ERHRP和cytAPEX对胞质及ER蛋白质的标记情况。
为全局性的表征ERHRP和cytAPEX的正交性，作者通过质谱对两种酶的标记蛋白质进行了定量比较，从图3中可以看出，ER定位的蛋白质富集在ERHRP高标记的区域，这一结果表明ERHRP和cytAPEX确实可以区分胞质和ER定位蛋白质。
图3：基于质谱的蛋白质组分析验证ERHRP和cytAPEX的正交性。
在验证了方法的可行性后，作者以TTR为模型蛋白评估该策略量化ER输入效率的能力。TTR是最丰富的血浆蛋白之一，应激条件下会发生胞质中的错误定位。之前的研究发现，胞质中未成熟的TTR会被转运进ER并完成切割以形成成熟的TTR。与之前的报道一致，作者发现cytAPEX只能标记未成熟的TTR，而ERHRP则强烈地标记了成熟的TTR（如图4所示）。此外，当TTR的切割位点被突变后，作者在ERHRP的标记中同时检测到了成熟和未成熟形式的TTR（如图5所示）。这些结果都有力地证明了该策略评估ER输入效率的能力。
图4：cytAPEX及ERHRP对TTR的标记效果。
图5：cytAPEX及ERHRP对切割位点突变的TTR的标记效果。
TTR是一种已知的ER pQC的底物。内质网应激会导致TTR输入的减少，而错误定位的TTR会被重新导向蛋白酶体进行降解。当用Tg（SERCA抑制剂）及MG132（蛋白酶体抑制剂）处理细胞时，作者发现cytAPEX标记到了更多的未成熟TTR，即胞质中未成熟TTR的含量增加。此外，在不同的实验条件下，ERHRP标记TTR的强度是相似的，这与之前的报道一致，即只有小部分TTR受ER pQC的影响（如图6所示）。
图6：Tg导致TTR错误定位。A）蛋白质免疫印迹相关结果；B）cytAPEX标记TTR的强度比较。
尽管TTR是被表征最好的pQC底物之一，但TTR导入减少的机制仍不清楚。所以作者决定研究内质网应激下游的信号通路是否能调节TTR输入。内质网应激通过UPR重塑细胞蛋白质稳态，而UPR由三条信号通路组成，即PERK、ATF6和IRE1/XBP1s。作者使用HEK293DAX细胞系进行研究（以HEK293DYG作为对照），HEK293DAX细胞系可以在无压力条件下通过小分子诱导XBP1s（Dox）和ATF6（TMP）的激活。作者发现ATF6而非XBP1s在激活条件下可以导致胞质TTR的增加，表明ATF6可能介导了应激诱导ER pQC对TTR输入的影响（如图7所示）。
图7：ATF6介导应激诱导ER pQC对TTR输入的影响。A）实验流程；B）UPR下游通路的特异性激活；C，D）ATF6及XBP1s激活对TTR输入的影响。
综上，作者借助ERHRP - cytAPEX实现了活细胞内对蛋白质转运过程的监控。作者认为该策略可以被用于表征蛋白质转运过程中相关调控因子的功能。
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ACS Chem. Biol. 2022, ASAP
Publication Date: June 8, 2022
https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00405
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